特洛伊木马--- 外泌体蛋白开启1型糖尿病患者的自身免疫反应
景杰编者按：
1型糖尿病是一类严重威胁人们健康的疾病，患者除了出现酮症酸中毒等严重急性症状外，还会出现一些针对自身的免疫并发症。人们长期关注1型糖尿病如何导致beta胰岛细胞被免疫系统攻击，然而目前对该过程仍然了解甚少。外泌体（exosome）是由真核细胞分泌的一类具有磷脂双分子膜结构对囊泡，其直径在30到150nm之间。外泌体膜上和囊泡内部含有蛋白质、脂类、核酸等具有重要生理功能等生物大分子，近期的研究表明它在免疫调节中也发挥重要的功能。在此背景下，瑞士洛桑联邦理工学院的Steinunn Baekkeskov教授，分别从人和大鼠中分离到胰岛细胞释放的外泌体，并且利用蛋白质质谱技术鉴定到T1D, GAD65, IA-2和proinsulin等自体抗原。这些存在于外泌体中的抗原蛋白被树突细胞捕获后会激活下游的免疫反应，启动beta胰岛细胞的自体免疫。景杰生物作为全球的蛋白质组学及蛋白质修饰领域的领跑者，可以为您提供从组学筛选到抗体定制的全套解决方案，为您的科研助一臂之力。
糖尿病是一类以高血糖为特征的代谢性疾病，临床上除了表现为多饮、多食和体重减轻等症状外，还会导致一些组织或器官产生病变，并产生酮症酸中毒、肢体坏疽、心脏病肾功能衰竭等严重并发症。目前糖尿病发病率日益增高，已成为世界性的常见病，严重影响人们的健康，降低人们的生活质量。糖尿病主要有以下三种类型：1型糖尿病多是因为自身免疫系统破坏产生胰岛素的胰岛细胞；2型糖尿病主要是细胞对胰岛素的敏感性降低（胰岛素抵抗），导致血液中葡萄糖积累；第三类是妊娠糖尿病，它和2型糖尿病类似，也是源于细胞的胰岛素抵抗，但多由于孕妇在孕期分泌的激素导致，通常会在产后自愈。
1型糖尿病会导致严重的免疫后果，伴随着循环系统中出现自身抗体，胰腺langerhans细胞的浸润，最终导致beta胰岛细胞被自身的免疫系统攻击而被清除（图1），使得产生的胰岛素不能满足生理需求。目前关于外泌体参与免疫反应中的报道逐渐增多，因此作者这里主要想研究胰岛细胞外泌体的蛋白构成，并分析相关蛋白质在自体免疫中的作用。
图1 在1型糖尿尿病胰脏中，beta胰岛细胞被免疫系统攻击，功能受到损伤。
作者首先分别从大鼠和人的beta胰岛细胞中分离到胞外囊泡，电镜分析表明这些囊泡直径在30到200nm左右 （图 2）。利用蛋白质质谱技术，作者鉴定到约30种蛋白。其中一些如GAD65和IA-2等是外泌体中的标志性蛋白，它们在随后的Western blotting实验中得到验证。有趣的是，作者在外泌体蛋白中发现胰岛素和胰岛素原蛋白的身影。通过严格的分级提取，作者证实：实验中检测到的胰岛素的确源于外泌体，而非提取过程中的污染所致；并且外泌体中部分胰岛素以胰岛素原的形式存在（图3）。
图2 从大鼠和人的胰岛细胞样品分离到的胞外囊泡的电镜图。
图3 利用ELISA检测外泌泌体中insulin的含量（C），
以及proinsulin的比例（D）。
接下来作者通过外泌体上自体抗原GAD65来分析外泌体的生成途径。利用免疫荧光共定位技术，作者证实胰岛细胞的外泌体源于胞内反式-高尔基体途径生成。最后就是研究这些外泌体在糖尿病导致的自身免疫过程中扮演的角色。首先通过bodipy-Ceramide染料标记大鼠胰岛外泌体，将其和骨髓源树突细胞孵育2到3小时后，这些外泌体会逐渐被树突细胞所摄取。同时摄取外泌体后，这些细胞会加速分泌一些炎症因子：如 α-TNF，IL6和IL1β（图 4）。因为内质网ER胁迫和胰岛细胞的功能紊乱相关，因此作者接下来分析，细胞因子导致的ER胁迫是否会影响外泌体的蛋白构成或其释放。结果表明经细胞因子处理后，外泌体在形态上并不会发生变化，但是蛋白含量增加了2到3倍。这些含量增加的蛋白中， 很多是具有免疫原性的蛋白，如分子伴侣Gp96 （图 5），当其离开内质网，定位到细胞膜或被释放到胞外后会导致免疫反应。
图4 骨髓源树突细胞经外泌泌体刺刺激后，
分泌泌的细胞因子TNF α 和IL6显著增加。
图5 经细胞因子刺刺激后，
胰岛细胞产生的外泌泌体中内质网分子伴侣Gp96含量量显著增加。
在本研究中，作者通过蛋白质组学的方法鉴定胰岛细胞产生的外泌体蛋白，并找到一些新的自免疫抗原，随后的实验证实这些外泌体响应外界的细胞因子，启动自免疫反应 （图 6）。该研究一方面加深我们对外泌体在糖尿病中作用的认识，同时还提示可以通过外泌体信号途径-干预免疫信号传递，为糖尿病的治疗提供新的思路。
图6 胰岛细胞分泌泌的外泌泌体产生自身免疫的示意图。细胞因子可以诱导胰岛细胞内内质网（ER）胁迫信号，导致内质网蛋白被装载于外泌泌体囊泡中，同时ER胁迫诱导外泌泌体分泌，ER的蛋白在胞外被抗原提呈细胞APC识别，导致外泌体被吞噬，启动免疫系统识别并清除β胰岛细胞的过程。
Primary human and rat beta cells release the intracellular autoantigens GAD65, IA-2 and proinsulin in exosomes togetherwith cytokine-induced enhancers of immunity. ChiaraCianciaruso, et al., 2016, Diabetes